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バイオ3Dプリンターでの軟骨再生への道が拓ける ― 京都大学

Fig. 1 各MSCの軟骨への分化能の比較


京都大学のDenise Zujur研究員および池谷真准教授(CiRA臨床応用研究部門)らの研究グループは、中山功一教授(佐賀大学医学部 附属再生医学研究センター)、味の素株式会社らのグループと共同で、iPS細胞から作製した間葉系幹細胞(iMSC)を用いて、神経堤細胞注を経て軟骨スフェロイドを作製する方法を確立した。剣山メソッド型のバイオプリンターなどを利用した軟骨組織の構築の道が拓けたといえるだろう。画像は各MSCの軟骨への分化能の比較(出典:CiRA)

研究の背景

軟骨は、関節を滑らかに動かす役割をする組織だが、血管を持たないため、細胞の増殖や分化を促進するために必要な物質の供給が不十分だ。そのため、軟骨は一旦損傷すると修復が難しく、関節痛や変形などの原因となることがある。

現在は再生医療として、患者自身の体から取り出した軟骨細胞や間葉系幹細胞を培養し、軟骨へと分化させて移植する取り組みが始まっている。しかし、この手法では、細胞提供者に由来する合併症、限られた増殖能、脱分化などの課題があった。iPS細胞は体の外で大量に培養することができるので、細胞治療用の軟骨を大量に作るための材料の一つとして期待されている。また、血液の細胞から生成でき、あらかじめ作製し保存されているiPS細胞も利用できるため、細胞採取の際に患者にかける負担が少なくなる。

これまでに研究グループではiPS細胞から神経堤細胞を経由して間葉系幹細胞を作製し(iMSC)、得られたiMSCがさまざまな細胞に分化すること、創薬や疾患モデリングに利用できることを示してた。また、再生医療用の細胞を作製するために、動物由来成分を含まない方法でiMSCを培養する方法を確立している。今回の研究では、軟骨への分化を促進する低分子化合物としてTD-198946を使い、iMSCから高品質な軟骨の塊(スフェロイド)を作製することを目指した。

研究結果

今回の研究では、「1. iMSCは軟骨へと分化することができる」「2. 低分子化合物と三段階の誘導により軟骨分化を促進する」「3. iMSC由来の軟骨スフェロイドは生体内でも軟骨の状態を維持することができる」「4. iMSC由来の軟骨スフェロイドは数日で融合する」という4つの内容が示された。

1. iMSCは軟骨へと分化できる

iMSCから軟骨様組織を作るための効率的な分化方法を確立するために、異なる条件で作られた複数のiMSC(T1-iMSCおよびXSF-iMSC)と骨髄由来MSC(BM-MSC)を比較検討した。T1-iMSCは他と比べて軟骨形成に優れていると同時に、骨や脂肪は形成しにくいことがわかった。

各MSCの軟骨への分化能の比較(出典: CiRA)


軟骨組織を青く染めるアルシアンブルー染色を行なった結果。T1-iMSCが最も青く染まっており、軟骨によく分化していた(上段)。一方、骨や脂肪への分化はあまり見られなかった(中段・下段)。スケールバー:100 μm

2. 低分子化合物と三段階の誘導により軟骨分化を促進する

MSCの軟骨分化は、従来TGF-βや骨形成タンパク質(BMP)などの因子で持続的に刺激することで行われてきたが、近年では、段階的に分化させる方法が登場している。研究グループは、TGF-βとBMPに加えて、軟骨形成を促進する低分子化合物であるTD-198946(TD)を使い、軟骨スフェロイドを作る方法として、従来の方法と三段階誘導法とを比較。段階的に分化させて作られた軟骨スフェロイドは、従来の方法のものと比較して、高品質(関節軟骨マーカーであるRPG4の発現が高く、肥大軟骨マーカーであるCOL10A1の発現が低い)であることがわかった。

従来法と三段階誘導法との比較(出典:CiRA)

三段階誘導法で誘導した軟骨スフェロイドは従来法と比較して、関節軟骨マーカーであるRPG4の発現が高く、肥大軟骨マーカーであるCOL10A1の発現が低く、高品質であることがわかる。

3. iMSC由来の軟骨スフェロイドは生体内でも軟骨の状態を維持できる

研究グループは軟骨スフェロイドを生体内に移植した際にその性質が維持されるかどうか確かめた。T1-iMSCあるいはBM-MSCから作製した軟骨スフェロイドを、免疫不全マウスの皮下に移植し、8週間後に移植したスフェロイドを採取し、顕微鏡で観察したところ、BM-MSCから作製した軟骨スフェロイドには、8週間後には軟骨様組織の他に石灰化し、骨様組織ができていた。一方で、T1-iMSCから作製した軟骨スフェロイドは、8週間後でも軟骨として残っていた。

移植した軟骨スフェロイドの組織染色(出典:CiRA)

青色の部分はアルシアンブルー染色で染まった軟骨。茶色はコッサ染色で染まった石灰化した部分。このことから「iMSC由来の軟骨スフェロイドは生体内でも軟骨の状態を維持することができる」といえる。


4)iMSC由来の軟骨スフェロイドは数日で融合する
 段階的に分化させる方法で作られた軟骨スフェロイドは、近くに存在していると接着し、7日目には完全に融合していた(Fig. 4)。

軟骨スフェロイドの顕微鏡写真(出典: CiRA)

つまり欠損した箇所に、人工培養した軟骨組織を配置することで、欠損が修復できる。

まとめと展望

今回の研究では、軟骨を修復・再生する能力をもつ軟骨前駆細胞をiMSCから製造する方法が開発されたこの方法により、軟骨前駆細胞を安定的に大量に製造することができると考えられる。また、剣山メソッド型のバイオプリンターなどの技術を利用して大きな軟骨組織を構築し、大欠損を修復できる可能性が示されたといえる。いままで修復できないと言われていた軟骨再生の取り組みが実現すると、関節痛に悩む高齢者の治療に活用できるため、大きな希望となるだろう。

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